I det sekundære behandlingstrin fjernes organiske stoffer, næringsstoffer (kvælstof og fosfor), samt hovedparten af de suspenderede stoffer, der passerede gennem primær behandlingen. Oftest anvendes de biologiske processer som den sekundære proces, hvor mikroorganismer omsætter organiske stoffer og næringsstoffer til vækst. De to mest almindelige biologiske processer til spildevandsbehandling er hhv. aktivt slam og biofilm. Aktiv slam processen sikre væksten og dannelsen af flocke med microorganismer, der findes i spildevandet eller i det aktive slam, som recirkuleres i processen. Flockene indeholder organismer, der kan fjerne forureningen i hhv. aerobe, anoxiske og anaerobe miljøer. Når de forurenende stoffer er fjernet, sendes spildevandet inkl. flocke til efterklaringstanken, hvor flockene bundfældes som slam, og derved separeres fra vandet. En del af slammet fra efterklaringstanken sendes retur i processen (Return Activated Sludge) og blandes med det indkomne spildevand, hvorved den aktive biologiske fjernelse af forurenende stoffer kan fortsætte på det nye spildevand. Den resterende del af slammet fjernes fra processen (Waste Activated Sludge), for at skabe idelle betingelser for rensning af spildevandet i processen. Processen med biofilm reactor kræver, at mikroorganismerne kan vokse på et medie i tanken og derved danne en biofilm. Spildevand blandes med eller spredes over mediet hvor biofilmen er etableret. Mikroorganismerne i biofilmen fjerner de forurenende stoffer. Ligesom i den aktive slam proces sendes de dele af biofilmen der rives løs under processen videre til en efterklaringstank, hvor slam og vand separeres.
For at en biologisk behandling kan fungere effektivt kræver mikroorganismerne næringsstoffer i et afbalanceret forhold, herunder kulstof, kvælstof og fosfor (refereret til som C:N:P) samt andre komponeneter som jern, kobber, zink, nikkel, mangan, kalium, svovl m.fl. der typisk findes i spildevand. Det almindeligt accepterede C:N:P forhold i renseanlæg er 100:5:1. Nogle anlæg fungere fint selvom C:N:P forholdet afviger fra normalen, men andre anlæg vil opleve polysaccharid slamdannelse og/eller trådformet bakterievækst, som hæmmer biologien og nedsætter sedimenteringsevnerne i efterklaringen markant.
Forskellige typer af biologiske processer finder anvendelse i den sekundære behandling, bl.a plug flow aeration basins, complete mix aeration tanks, sequencing batch reactor (SBR), oxidation ditches, trickling filters, moving bed biological reactors (MBBR) samt integrated fixed film activated sludge m.fl.
Biologisk fjernelse af næringsstoffer (Biological Nutrient Removal, BNR) sker når mikroorganismerne afhængigt af miljøet fjerne kvælstof og fosfor fra vandet. En BNR-proces består af anaerobe (ingen ilt eller nitrat tilstede), anoxic (ingen ilt men nitrat til stede) og aerob (ilt til stede) stadier, som vandet passerer igennem i anlægget for at udføre de forskellige biologiske processer.
Kemiske behandlingsprocesser kan også anvendes, f.eks. kemisk fjernelse af fosfor. Ved at tilføre et kemisk fældningsmiddel i processen inden iltning og efterklaring, fjernes fosfor ved koagulering, idet det bindes til uopløselige forbindelser, der bundfældes og fjernes som slam i efterklaringen.